REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
93
Identificación molecular de Dípteros de importancia forense con el gen
(COI Barcode), La Paz Bolivia
Molecular identification of Diptera of forensic importance with the gene (COI Barcode), La Paz Bolivia
Emma Torres Tola
1
, Pamela Castillo Vega
2
& Andree Bernal Calderón
3
1
Bioquímica, M. Sc., Investigador, Universidad Policial “Mcal. Antonio José de Sucre” cingen@iitcup.org
2
Médico cirujano, M. Sc. Medicina Legal, Docente Investigador, Universidad Pública de El Alto. medlegiscastillo@gmail.com,
3
Oficial de Policía, M. Sc., Investigador, Universidad Policial “Mcal Antonio José de Sucre”.
Correspondencia: Dra. Pamela Castillo Vega -- medlegiscastillo@gmail.com
Recibido: 29-06-2020 Aceptado: 01-08-2020
Resumen
Una de las dificultades encontradas es la correcta identificación de insectos asociados a la descomposición
cadavérica, por la cual ha llevado a buscar y generar nuevas herramientas en biología molecular que
facilitan la determinación de especímenes para la estimación del Intervalo Post-Mortem de una forma
efectiva y certera a partir de estadios inmaduros; la colecta y taxonomía morfológica de Dípteros se
realizaron en primera instancia y posteriormente se utilizó el sistema de Códigos de Barras (COI Barcode)
para la identificación molecular de insectos problema por medio del gen mitocondrial COI en cualquier fase
del ciclo biológico. Identificando tres especies de adultos con una probabilidad de correspondencia del
100%; los especímenes: Sarconesia versicolor de la Familia Calliphoridae y Fannia sp., no fueron hallados
en las bases de datos mundiales del GenBank y del Boldsystems, siendo necesario su actualización
realizando patrones de sucesión cronológica de fauna cadavérica en diferentes zonas geográficas, cuya
práctica se aplicaría en las investigaciones criminales.
Palabras clave
Código de barras, taxonomía molecular, COI y Dípteros
Abstract
One of the difficulties encountered is the correct identification of insects associated with cadaveric
decomposition, which has led to the search and generation of new tools in molecular biology that facilitate
the determination of specificities for the modification of the Post-Mortem Interval in an effective and
accurate from immature stages; the collection and morphological taxonomy of Diptera were made in the
first instance and then the Bar Code System (COI Barcode) was used for the molecular identification of
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
94
problem insects by means of the mitochondrial COI gene in any phase of the biological cycle. Identifying
three species of adults with a probability of 100% correspondence; the specimens: Sarconesia versicolor of
the Calliphoridae Family and Fannia sp., were not found in the world databases of the GenBank and the
Boldsystems, being necessary to update them by chronological succession patterns of cadaveric fauna in
different geographical areas, whose practice would be applied in criminal investigations.
Key words
Bar code, molecular taxonomy, IOC and dipterans
INTRODUCCIÓN.
Los insectos necrófagos y en especial los Dípteros, son de gran interés al ser los principales responsables
de la reducción de materia orgánica en descomposición, incluidos los restos cadavéricos
1
. Tienen una
asociación directa con la materia orgánica en putrefacción, el estudio de la entomofauna necrófaga es
fundamental para la aplicación de la Entomología Forense
2
. Esta disciplina forense es la encargada de
examinar la fauna entomológica, con el objetivo de extraer información, para precisar el tiempo, lugar y
modo en el que ha tenido lugar un suceso
3
.
En Bolivia, se han realizado escasas investigaciones sobre la sucesión de la entomofauna cadavérica, siendo
el biomodelo más utilizado el cerdo doméstico (Sus scrofa)
4,5,6,7
Los estudios realizados tuvieron el
propósito de conocer a los insectos presentes en cadáveres en sus diferentes etapas de descomposición, los
de mayor importancia fueron los Dípteros de las familias Calliplioridae, Muscidae y Sarcophagidae, pero
no se logró identificar las especies en diferentes etapas de su desarrollo, huevos, larvas, puparium y adultos
8
. Para relacionar las distintas fases de descomposición, así como estimar el tiempo de muerte (Intervalo Post
- Mortem-IPM), conlleva a la cría de larvas en el laboratorio, recolectar pupas, lo que se traduce a un gasto
de tiempo y recursos, debido a que es una labor compleja
8
y que además requiere del conocimiento
taxonómico del especialista, confiando a menudo en el reconocimiento de pequeñas variaciones en las
características fenotípicas
9
. No obstante las semejanzas morfológicas de las diferentes especies,
especialmente en estadios inmaduros, dificulta su identificación y esto ocasiona a generar interés por el
desarrollo de nuevas alternativas, que ayuden a resolver estos problemas taxonómicos de manera exacta y
certera.
En este sentido, se ha desarrollado técnicas en biología molecular que facilitan la determinación de especies
empleando el material genético de los mismos. El estudio del sistema de Códigos de Barras, en insectos, se
desarrolla en el análisis del ADNmt que comprende alguna región de los genes que codifican el COI o
COII
9
. La obtención de secuencias de ADNmt han sido a partir del Gen COI, este gen es propuesta como
Barcode estándar para la mayoría de grupos de animales, es una región de 648 pares de base del gen
mitocondrial Citocromo C Oxidasa Sub Unidad 1 (COI), cuya efectividad ha sido demostrada en varios
trabajos de identificación de aves, peces, mariposas, moscas, entre otros
10,11
El gen COI, es de amplio uso para identificar especies de insectos problema
8
en cualquier estadio inmaduro,
así como con un simple fragmento de insecto que, en la mayoría de los casos no es tomado en cuenta debido
a la dificultad de identificar claves dicotómicas certeras. La identificación taxonómica molecular genética
de los insectos necrófagos, permite clasificar al insecto en cualquier estadio del ciclo de vida y a partir de
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
95
cualquier fragmento o estructura o tejido del mismo en un periodo de tiempo. Además de poder clasificarlos
a nivel de especies y subespecies.
El objetivo del presente estudio fue de realizar la identificación molecular rápida de la entomofauna
cadavérica en diferentes biomodelos para su posterior aplicación en investigaciones criminales.
Es así que el presente estudio examina a la ciencia entomológica desde un punto de vista de la biología
molecular moderna como un método complementario en datación de muerte y otros, tratando de contribuir
a las instituciones jurídicas del Estado Boliviano, Ministerio Público y Policía Boliviana, a la resolución
rápida de la investigación forense evitando de esta manera, la retardación de justicia de cualquier caso.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomó muestras de huevos, larvas en diferentes estadios y adultos a partir de los biomodelos (S. scrofa,
Cerdo domestico), muestras proporcionadas por la Dra. Castillo y el Tte. Bernal, con un intervalo
postmordem no mayor a 24 hrs. (Fig. 1), a los cuales se realizó una disección del insecto adulto de cabezas
con un peso estimado de 0,17g.
La extracción del material genético se realizó con el sistema Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega) de acuerdo al protocolo de Miller
12
. Para la amplificación de Barcode se empleó la pareja de
cebadores universales LCO1490 y HCO2198 descritos por Hebert
13
que permiten la amplificación de un
fragmento de 709 pb. Para la reacción de PCR se realizó empleando el kit comercial GoTaq® Colorless
Master Mix (Promega). Los productos amplificados fueron sometidos a una purificación alcohólica,
realizándose posteriormente el PCR desbalanceado empleando el kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems). Este producto fue secuenciado en un Analizador Genético ABI 3500
(Applied Biosystems) de acuerdo a las especificaciones del fabricante.
Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa Sequencing Analysis v.6.0. (Applied
Biosystems). Las secuencias se alinearon con el programa Mega 5.1. Las secuencias parciales y completas
del gen citocromo oxidasa I (COI) y relacionadas a las especies fueron descargadas del GenBank
14
y del
Boldsystems v.3.0.
15
Cabe mencionar que los árboles
filogenéticos fueron construidos a partir de
la plataforma bioinformática del Blast Tree
View, generados con los repositorios de los
datos del Genbank.
Figura 1. Colecta de muestras entomológicas
en estadios inmaduros. Fuente: Castillo, 2013
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
96
RESULTADOS
El análisis de secuencias incluyó 600 pares de bases correspondientes a la región 3´del gen COI, de donde
la identidad de las secuencias se verificó por comparación con la secuencia de referencia de Ianius mosca,
cuya secuencia se encuentra depositada en GenBank con número de acceso MF130285.1. En total se
obtuvieron diez secuencias. Se presenta la clasificación taxonómica molecular de 5 muestras de insectos
adultos, observándose en la muestra CG-M3-ENT una probabilidad de correspondencia de especie (P.C.)
del 100%, la muestra CG-M5-ENT presenta una P.C. de especie de 99,8% y la muestra CG-M6-ENT tiene
una P.C. de especie de 94%. (Tabla 1)
Tabla 1. Resultados de los algoritmos de las bases de datos mundiales BoldSystems y GenBank, Estadio Adulto.
NDB: No Determinado en Bases de Datos Mundiales.
No.
Código CINGEN
Estadio
Nivel
Taxonómico
Asignación de
Taxón
1
CG-M2-ENT
ADULTO
Filo
NDB
Clase
NDB
Orden
NDB
Familia
NDB
Género
NDB
Especie
NDB
2
CG-M3-ENT
ADULTO
Filo
Arthropoda
Clase
Insecta
Orden
Diptera
Familia
Calliphoridae
Género
Sarconesia
Especie
Sarconesia
chlorogaster
3
CG-M4-ENT
ADULTO
Filo
NDB
Clase
NDB
Orden
NDB
Familia
NDB
Género
NDB
Especie
NDB
4
CG-M5-ENT
ADULTO
Filo
Arthropoda
Clase
Insecta
Orden
Diptera
Familia
Calliphoridae
Género
Sarconesia
Especie
Sarconesia
versicolor
5
CG-M6-ENT
ADULTO
Filo
Arthropoda
Clase
Insecta
Orden
Diptera
Familia
Fanniidae
Género
Fannia
Especie
Fannia sp
Fuente: (CINGEN, IITCUP).
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
97
La muestra identificada como CG-M2-ENT (resaltado en amarillo) no fue encontrada en ninguna de las
bases de datos del GenBank y del Boldsystems. Sin embargo se encuentra emparentado con secuencias de
Sarconesia chlorogaster (Fig. 2). La muestra identificada como CG-M4-ENT (resaltado en amarillo) no fue
encontrada en ninguna de las bases de datos del GenBank y del Boldsystems. Sin embargo se encuentra
relacionado con secuencias de Sarconesia versicolor (Fig. 3).
Figura 2. Árbol filogenético de la especie identificada, CG-M2-ENT (resaltado en amarillo), construido con
programa Blast Tree View, método de Neighbor Joining (Saitou and Nei 1987) considerando 0.75 de Diferencia
máxima de Secuencia y una distancia de Jukes-Cantor (1969). Fuente: (GENBANK)
Figura 3. Árbol filogenético de la especie identificada, CG-M4-ENT (resaltado en amarillo), construido con
programa Blast Tree View, método de Neighbor Joining (Saitou and Nei 1987) considerando 0.75 de Diferencia
máxima de Secuencia y una distancia de Jukes-Cantor (1969).Fuente: (GENBANK).
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
98
Se presenta la clasificación taxonómica molecular de las 4 muestras de diferentes estadios inmaduros:
huevos, larvas de primer, segundo y tercer estadio. Las muestras de CG-M17-ENT y CG-M19-ENT se
observa la P.C. de la especie en un 100% y las muestras CG-M18-ENT y CG-M20-ENT presentan un P.C.
de la especie del 99.8%. (Tabla 2)
Tabla 2. Resultados de los algoritmos de las bases de datos mundiales BoldSystems y GenBank, de las diferentes
fases del ciclo biológico del insecto
Código CINGEN
Estadio
Nivel
Taxonómico
Asignación de
Taxón
Probabilidad de
Correspondencia (%)
1
CG-M17-ENT
PRIMER
INSTAR
Filo
Arthropoda
100
Clase
Insecta
100
Orden
Diptera
100
Familia
Calliphoridae
100
Género
Sarconesia
100
Especie
Sarconesia
chlorogaster
100
2
CG-M18-ENT
SEGUNDO
INSTAR
Filo
Arthropoda
100
Clase
Insecta
100
Orden
Diptera
100
Familia
Calliphoridae
100
Género
Sarconesia
100
Especie
Sarconesia
chlorogaster
99,8
3
CG-M19-ENT
TERCER
INSTAR
Filo
Arthropoda
100
Clase
Insecta
100
Orden
Diptera
100
Familia
Calliphoridae
100
Género
Sarconesia
100
Especie
Sarconesia
chlorogaster
100
4
CG-M20-ENT
HUEVO
Filo
Arthropoda
100
Clase
Insecta
100
Orden
Diptera
100
Familia
Calliphoridae
100
Género
Sarconesia
100
Especie
Sarconesia
chlorogaster
99,8
Fuente: CINGEN, IITCUP
DISCUSIÓN
En vista de que es crucial la identificación de la fauna entomológica cadavérica para ayudar a establecer el
IPM en el curso de la investigación de los hechos, la determinación precisa de las especies de las larvas
halladas en los cadáveres, así como de las pupas que los rodean es de suma importancia y, pese a la escases
de estudios que emplean secuencias de COI para identificar factores de importancia forense
16
, los resultados
obtenidos del análisis genético de la presente investigación muestra la caracterización taxonómica de cinco
especímenes adultos obteniendo una probabilidad de correspondencia igual al 100% en dos muestras y de
99.8% en una muestra (Tabla 1), dos muestras no fueron encontradas en las bases de datos del GenBank y
del Boldsystems. En la figura 1, la muestra M2 (resaltado en amarillo) se encuentra en la rama de
especímenes Sarconesia chlorogaster. No obstante esta secuencia es diferente a los especímenes
comparados llevándonos a sugerir una subespecie. En la figura 2, la muestra M4 (resaltado en amarillo),
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
99
secuencia no hallada en las bases de datos internacionales, tiene semejanza a la secuencia de referencia
Sarconesia versicolor.
Así mismo, se ha logrado realizar el análisis genético de diferentes fases del ciclo biológico del insecto
(huevo, instar 1, instar 2 e instar 3), en vista de, que la información específica contenida en la molécula de
ADN y en particular en el gen COI, se caracteriza por su inmutabilidad durante todos los cambios del insecto
(tabla 2). Las secuencias de COI de cada especie fueron únicas y distinguibles entre sí, aunque mostraron
alta homología. Este trabajo puso de manifiesto que la identificación de especies de dípteros inmaduros por
análisis de secuencias del ADN resulta sencilla, economiza tiempo al eliminar la necesidad de esperar a la
emergencia del adulto y elimina el requerimiento de un conocimiento altamente especializado de claves
morfológicas. Además, proporciona información, no sólo del Intervalo Post-Mortem, sino también de las
condiciones ambientales que rodean a los cuerpos
17
.
CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, podría concluirse que el uso del Citocromo Oxidasa Subunidad
I (COI) como herramienta en la identificación taxonómica se mostró una región de fácil amplificación y
secuenciación, que pueden ser utilizadas como complemento en la identificación de dípteros de interés
forense, lo que daría un mayor soporte y consistencia a las investigaciones criminales. La metodología
utilizada y propuesta por el sistema de identificación universal "ADN Barcode "fue eficiente en la
identificación de la mayoría de las especies de la Familia Calliphoridae y Muscidae, objetos de estudio del
presente trabajo, sobre todo en la identificación de los especímenes de diferentes fases del ciclo biológicos
del insecto.
La presente investigación ha identificado secuencias genéticas del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I,
COI (COI Barcode) no incluidos en las bases de datos mundiales de GenBank y Boldsystems, por lo tanto
se considera un aporte científico al incorporar nuevos datos al sistema.
Sin embargo su aplicación no estaría completa si no se cuentan con los especímenes identificados en otras
épocas del año, y en las distintas regiones geográficas del país para tener una base de datos completa, esta
situación obliga a que se realicen más investigaciones tomando en cuenta todas las características
mencionadas, para así tener una mejor aplicabilidad por el personal involucrado en investigación judicial:
policía, médicos forenses, criminalistas, etc. Y lograr aplicar como pericia de manera eficiente en un marco
estrictamente académico y científico.
REFERENCIAS
1. Peralta B, GilArriortua M, Saloña MI. Variabilidad espacial y temporal de Califóridos
(Diptera) necrófagos de interés forense capturados en la Comunidad Autónoma del Principado de
Asturias (CAPA). Estudio preliminar. Boletín de la Asociación española de Entomología. 2013;
37:301-314.
2. GilArriortua M., Saloña-Bordas M. I., & Pancorbo M. M. Uso de vestigios moleculares en
entomología Forense. Ciencia Forense. 2015; 29–72.
3. Greenber B, Kunich JC (eds.). Entomology and the law: Flies as forensic Indicators. Cambridge
University Press, Cambridge. 2002
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
100
4. Sakuma Calatayud, E. Caracterización de entomofauna cadavérica y tiempo de desarrollo
larvario en la localidad de Mecapaca La Paz. La Paz Bolivia: tesis de grado. 2005.
5. Chávez Abasto Dorian Sandy, R. A. Investigación de fauna cadavérica de importancia forense y
determinación del intervalo posmortem a través del estudio de muestras entomológicas En
Cochabamba Bolivia. Rev.Inv.E Info Salud. 2008; 3(7):1-15.
6. Castillo Vega, P. A. Caracterización de la entomofauna asociada a cadáveres de cerdo (sus
scrofa) fallecidos por lesiones producidas por heridas por arma blanca, en el municipio de
Pucarani de la provincia Los Andes del departamento de la Paz-Bolivia, mayo a julio del 2013.
Tesis, Universidad Mayor de San Andrés, La Paz, La Paz- Bolivia. 2013
7. Acho. Identificación de la entomofauna cadavérica asociada a la presencia de artrópodos en
contexto de valle, localidad de millares municipio de Betanzos departamento de Potosí gestión
2008. Revista de Tecnología y Ciencias de la Salud. Junio 2014 Vol.1 No.1 48-65.
8. Solano J., Castro M. Identificación molecular de califóridos (Diptera: Calliphoridae) de
importancia forense en Colombia. Revista Colombiana de Entomología. Julio - diciembre 2013;
39 (2): 281-290.
9. Wells JD, Stevens JR. Molecular methods for forensic entomology, pp. 437-452. Byrd JH,
Castner JL (eds.). Forensic entomology: The utility of arthropods in legal investigations. CRC
Press, Boca Raton. 2010.
10. Meiklejohn KA, Wallman JF, Dowton M. DNA-based identification of forensically important
Australian Sarcophagidae (Diptera). International Journal of Legal Medicine. 2009; 125:27-32.
11. Barcode of life. What Is DNA Barcoding? 2017 Obtenido de
http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dna-barcoding.
12. Miller, S., Dykes, D., & Polesky, H. A simple salting out procedure for extracting DNA from
human cells. Nucleid Acid Research.1988; 16(3), 1215.
13. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., & De Waard, J. R. Biological Identifications through
DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society B, 270(1512).2003; 313–321.
doi:10.1098/rspb.2002.2218,
14. Benson, D., Cavanaugh, M., Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., Ostell, J., & Sayers, E.
GenBank. Nucleid Acids Research, 41, D36 - D42. 2013; doi:10.1093/nar/gks1195.
15. Ratnasingham, S. and Hebert, P.D.N. BOLD: The Barcode of Life Data System
(http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes.2007; 7, 355-364.
16. Zhuang Q., Cai J., Zhang M., Feng H, Guo Y. and Lan L. Molecular indentification of
forensically significant beetles (Coleoptera) in China Based on COI gene. Revista Colombiana
de Entomol. 2011; gia 37: 95-102.
17. Pancorbo M. de, Ramos R., Saloña M., Sanchez P. Entomología molecular forense. Ciencia
Forense.2006; 8:107-130.
18. Boehme P., Amendt J., Zehner R. The use of CoI barcodes for molecular identification of
forensically important fly species in Germany. Parasitology Research. 2012; 110: 2325-2332.
19. Hofer, I.M.S., Hart, A.J., Matin-Vega, D. & Hall, M. J. R. Optimising crime scene temperature
collection for forensic entomology casework. Forensic Sci Int. 2017 Jan;270:129-138. doi:
10.1016/j.forsciint.2016.11.019. Epub 2016 Nov 17.
20. Morlais I, Severson DW. Complete mitochondrial DNA sequence and amino acid analysis of the
cytochrome c oxidase subunit I (COI) from Aedes aegypti. DNA sequence. 2002; 13 (2):123-
127.
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA Vol. 37 (2) Septiembre 2020
REVISTA MEDICINA LEGAL DE COSTA RICA
ISSN 2215-5287
101
21. Wells JD, Wall R, Stevens JR. Phylogenetic analysis of forensically important Luciliaflies based
on cytochrome oxidase I sequence: A cautionary tale for forensic species determination.
International Journal of Legal Medicine.2007; 121:229-233.
Attribution (BY-NC) - (BY) You must give appropriate credit, provide a link to the license, and indicate if changes
were made. You may do so in any reasonable manner, but not in any way that suggest the licensor endorses you or
your use. (NC) You may not use the material for commercial purposes.