ESTUDIOS INMUNOFENOTÍPICOS
DE LOS LINFOCITOS B y T
Summary
Advances in immunological techniques in the last decade have made posible the identification of specific receptors, antigens and other molecules on the membrane and/or the cytoplasm of lymphoid cells. Beside morphological characterization, immunological marker analysis can further characterize the cells of the various hematopoyetic differentiation stages. Although immunological markers represent differentiation antigens, they usually are not specific for one differentiation stage, but are expressed in several stages. However, the expression of a specific set of markers can designate a cell to a particular differentation stage.Several markers are not restricted to one differentiation lineage, but are expressed in several lineages (B-, T- or myeloid lineage) The LLA and the chronic lymphocytic leukemias are the malignant counterparts of cells in immadure and more mature differentiation stages.
Introducción
Fundamentos y aplicaciones de la Citometría de flujo en Hematología:La citometría de flujo ( CMF) constituye un método reciente e innovador de análisis celular a través del estudio de diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas de la célula. Su desarrollo se ha visto impulsado de forma importante por los avances ocurridos en los últimos años en campos tan diversos como la producción de anticuerpos monoclonales contra antígenos celulares, la química de los fluorocromos, la tecnología laser, las tinciones citoquímicas y la informática.
Así, su empleo como una potente herramienta analítica incorporada a la infraestructura tecnológica previamente disponible ha supuesto su rápida difusión en las últimas décadas a un amplio conjunto de especialidades biomédicas como la inmunología, la hematología, la oncología, la anatomía patológica y la biología celular (3, 4, 11).
Aplicaciones en Hematología:La
caracterización de las diferentes poblaciones celulares normales
de sangre periférica y médula ósea constituye
una de las más extendidas e importantes aplicaciones actuales de
la Citometría de Flujo. Si bien en un principio su utilidad
se limito al análisis fenotípico de las células, el
desarrollo de nuevos fluorocromos y anticuerpos monoclonales permite en
la actualidad la valoración funcional de las mismas (4).
Además de la caracterización morfológica, el análisis
de marcadores inmunológicos pueden adicionalmente caracterizar las
células de los varios estadíos de diferenciación hemopoyética.
Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos
de diferenciación, ellos usualmente no son específicos para
un estado de diferenciación, sino que son expresados en diversos
estados. Sin embargo, la expresión de un grupo específico
de marcadores pueden designar a una célula a un estadío de
diferenciación particular (3-10).Diferenciación
Inmunofenotípica de Linfocitos B y TEl
precursor antigénico CD 34 es encontrado en la mayoría de
las células inmaduras tanto linfoides como mieloides. El HLA-DR
esta expresado en células inmaduras de la diferenciación
hemopoyética (células tronco hemopoyéticas).
Las células tronco totipotenciales solo presentan reactividad para
CD34, pero también en células B, células monocíticas
y linfocitos T activados. La enzima TdT esta presente en el núcleo
de células linfoides inmaduras, pero desaparece cuando son expresados
los receptores antigénicos específicos (1-2,
8,
4, 6,
11).Diferenciación
de los linfocitos T:
Los linfocitos T se originan
a partir de un precursor linfoide en la médula ósea desde
donde migran al timo para su diferenciación.
Durante su maduración en el timo, los linfocitos T experimentan reagrupamientos genéticos que generan el receptor de la célula T (TCR) funcional. Este proceso se acompaña del desarrollo de otros antígenos. El esquema más aceptado en la actualidad divide a las células T inmaduras (timocitos) en tres estadíos de desarrollo, en los cuales la citometría de flujo ha desempeñado un papel fundamental (7, 11) (figuras 10 y 11).
Los timocitos precoces (estadío
1) expresan CD2 y CD5, además de CD7, CD38 y CD71. Al desarrollarse
las células en timocitos comunes (estadío 11) adquieren CDla,
CD4 y CD8. En esta fase la molécula CD3 se encuentra en el
citoplasma y todavía no esta presente en la superficie. Los
linfocitos T experimentan procesos de selección positiva y negativa
durante los cuales se selecciona el CD4 o CD8, de acuerdo a sí el
receptor esta restringido a antígenos HLA de clase 1 o de clase
11 (1) (Figura 12).
El paso de timocito maduro a célula T periférico viene señalado por la pérdida de parte de su reactividad para el antígeno CD38.
Tras la selección tímica, menos del 1% de los linfocitos generados en el timo sobreviven y pasan a la circulación (7).
Los linfocitos T periféricos pueden encontrarse en un estado de reposo o activados. Estos dos estados pueden diferenciarse por algunas características inmunofenotípicas. Tras la activación, los linfocitos T adquieren el receptor para la Interleucina 2. Además, los linfocitos T activados pueden expresar antígenos HLA-DR que normalmente no se expresan en reposo y el CD 71 que es el receptor para la transferrina (1, 2, 7).
Otros antígenos
de los, linfocitos T.
Los antígenos CD2,
CD3 y CD5 se encuentran presentes en todos los linfocitos T normales y
un cuarto antígeno, el CD7, está presente en aproximadamente
el 85% de las células T periféricas. Estos cuatro antígenos
se denominan pan T. El antígeno CD2 es el lugar de unión
de los hematíes de carnero en la formación de rosetas.
El antígeno CD3 se encuentra unido de forma no covalente al receptor
del antígeno de célula T y éste complejo es esencial
para la activación dependiente del antígeno de los linfocitos
T. A su vez. El CD5 funciona como la molécula que une al antígeno
BC72 (1, 7).
Diferenciación
de los linfocitos B:
Los linfocitos B se originan
en la médula ósea donde experimentan una fase primaria de
diferenciación. La diferenciación de las células
B va acompañada de una serie de cambios en el genotipo (reordenamientos
en los genes de las inmunoglobulinas similar al del receptor TCR de los
linfocitos T), y de la adquisición y pérdida en la membrana
de una serie de antígenos. El desarrollo de las células
B puede dividirse en tres estadíos amplios: células pre-B,
que son los precursores de las células B inmaduras que no han adquirido
aún las inmunoglobulinas de superficie; células B, células
B maduras inmunocompetentes que expresan inmunoglobulinas de superficie
y células plasmáticas, que son células de estirpe
B diferenciadas terminalmente, que han perdido las inmunoglobulinas de
superficie que funcionan para producir inmunoglobulina en cantidades masivas
(figura 13).
La citometría de flujo ha sido fundamental en el establecimiento de las etapas de diferenciación de los linfocitos B (1, 7).
El desarrollo de los marcadores
de superficie de las células B es el siguiente: los precursores
más inmaduros expresan solo los antígenos HLA-DR y el CD34,
mientras que los antígenos CD19, CDIO y CD20 se van expresando secuencialmente,
seguido de la expresión de las cadenas pesadas y citoplasmáticas
y finalmente de las inmunoglobulinas de superficie. La transición
de éste último estadío se acompaña de la pérdida
del antígeno CD 10 (7, 11).
Una vez que los linfocitos adquieren IgM de superficie, se considera que
se han convertido en células B maduras. Las células
B maduras expresan IgM de superficie y/o IgD, antígenos de clase
11, C3 y receptores Fc de IgG y los antigenos pan de células B.
La mayoría expresan CD24 y CD21. Una pequeña fracción
de células B de los adultos normales expresan el antígeno
CD45. La diferenciación de las células B posterior
a la médula ósea no se conoce muy bien y no es posible definir
con exactitud los estadíos discretos por la expresión de
antígenos particulares. Las células B terminalmente
diferenciadas o células plasmáticas difieren fenotípicamente
de la mayoría de células B. Carecen de los antígenos
de clase II, del antígeno pan de leucocitos CD45 y de la mayoría,
sino de todos los antígenos pan de células B. Se encuentran
ausentes las inmunoglobulinas de superficie, aunque son abundantes las
inmunoglobulinas citoplasmáticas (1, 7,
11).Antígenos
característicos de los linfocitos B:
Los antígenos específicos
de los linfocitos B son CD19, CD20 y CD22. El antígeno CD
19 se expresa muy precozmente en el desarrollo de las células B
y continúa su expresión hasta justo antes de la diferenciación
en células plasmáticas. El CD20 se expresa más
tardíamente que el CD19 en el desarrollo de los linfocitos B y parece
estar relacionado con la expresión de las cadenas pesadas citoplasmáticas.
El CD22 es específico de los linfocitos B y se pierde durante su
transición a células plasmáticas (1,
7).
Las células
NK ( asesinas naturales):
Las células NK carecen
de marcadores de células T o B específicos y tienen la capacidad
de destruir células infectadas por virus y ciertas células
tumorales, todo ello sin sensibilización previa (actividad natural).
Las células NK se originan a partir de un precursor hemopoyético
en la médula ósea, donde maduran y desde donde pasan a la
circulación, sin embargo, su proceso de diferenciación se
desconoce en gran medida. La citometría de flujo con marcaje
múltiple ha sido fundamental en la caracterización fenotipica
de estas células. La mayoría de células NK se
caracterizan fenotipicamente por la expresión de CD2 y el pan T
CD7. Las células NK expresan también las moléculas
CD 11a-c Y CD 1 8 asociadas a función linfocitaria. Los antígenos
CD16, CD56 y CD57 son marcadores que reconocen células con actividad
NK, definiendo las células NK en ausencia de CD3/ TCR (1,
7).
ResumenDurante la última década, avances en las técnicas inmunológicas han hecho posible la identificación de receptores específicos, antígenos y otras moléculas sobre la membrana o el citoplasma de las células linfoides. Además de la caracterización morfológica, el análisis de marcadores inmunológicos pueden caracterizar adicionalmente las células hemopoyéticas de los varios estados de diferenciación. Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos de diferenciación, ellos no son específicos para un estado de diferenciación, sino que se expresan en diversos estados. Sin embargo, la expresión de un grupo específico de marcadores puede asignar a una célula en un estado particular de diferenciación. Diversos marcadores no restringen a un estado de diferenciación, sino que son expresados en diversos linajes (linaje B, T o mieloide). Las LLA y las leucemias linfocíticas crónicas son las contrapartes malignas de los estados de diferenciación inmaduros y más maduros.
Bibliografía
*
Laboratorio Clínico, Hospital Calderón Guardia
**
Laboratorio Clínico, Hospital San Vicente de Paul