GENÉTICA

ESTUDIOS INMUNOFENOTÍPICOS
DE LOS LINFOCITOS B y T
 


Marianela Trejos Herrera*, Virginia Chacón Zamora**


 


Summary

Advances in immunological techniques in the last decade have made posible the identification of specific receptors, antigens and other molecules on the membrane and/or the cytoplasm of lymphoid cells.  Beside morphological characterization, immunological marker analysis can further characterize the cells of the various hematopoyetic differentiation stages.  Although immunological markers represent differentiation antigens, they usually are not specific for one differentiation stage, but are expressed in several stages.  However, the expression of a specific set of markers can designate a cell to a particular differentation stage.Several markers are not restricted to one differentiation lineage, but are expressed in several lineages (B-, T- or myeloid lineage) The LLA and the chronic lymphocytic leukemias are the malignant counterparts of cells in immadure and more mature differentiation stages.

Introducción

Fundamentos y aplicaciones de la Citometría de flujo en Hematología:La citometría de flujo ( CMF) constituye un método reciente e innovador de análisis celular a través del estudio de diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas de la célula.  Su desarrollo se ha visto impulsado de forma importante por los avances ocurridos en los últimos años en campos tan diversos como la producción de anticuerpos monoclonales contra antígenos celulares, la química de los fluorocromos, la tecnología laser, las tinciones citoquímicas y la informática.

Así, su empleo como una potente herramienta analítica incorporada a la infraestructura tecnológica previamente disponible ha supuesto su rápida difusión en las últimas décadas a un amplio conjunto de especialidades biomédicas como la inmunología, la hematología, la oncología, la anatomía patológica y la biología celular (3, 4, 11).

Aplicaciones en Hematología:La caracterización de las diferentes poblaciones celulares normales de sangre periférica  y médula ósea constituye una de las más extendidas e importantes aplicaciones actuales de la Citometría de Flujo.  Si bien en un principio su utilidad se limito al análisis fenotípico de las células, el desarrollo de nuevos fluorocromos y anticuerpos monoclonales permite en la actualidad la valoración funcional de las mismas (4). Además de la caracterización morfológica, el análisis de marcadores inmunológicos pueden adicionalmente caracterizar las células de los varios estadíos de diferenciación hemopoyética.  Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos de diferenciación, ellos usualmente no son específicos para un estado de diferenciación, sino que son expresados en diversos estados.  Sin embargo, la expresión de un grupo específico de marcadores pueden designar a una célula a un estadío de diferenciación particular (3-10).Diferenciación Inmunofenotípica de Linfocitos B y TEl precursor antigénico CD 34 es encontrado en la mayoría de las células inmaduras tanto linfoides como mieloides.  El HLA-DR esta expresado en células inmaduras de la diferenciación hemopoyética (células tronco hemopoyéticas).  Las células tronco totipotenciales solo presentan reactividad para CD34, pero también en células B, células monocíticas y linfocitos T activados.  La enzima TdT esta presente en el núcleo de células linfoides inmaduras, pero desaparece cuando son expresados los receptores antigénicos específicos (1-2, 8, 4, 6, 11).Diferenciación de los linfocitos T:
Los linfocitos T se originan a partir de un precursor linfoide en la médula ósea desde donde migran al timo para su diferenciación.

Durante su maduración en el timo, los linfocitos T experimentan reagrupamientos genéticos que generan el receptor de la célula T (TCR) funcional.  Este proceso se acompaña del desarrollo de otros antígenos.  El esquema más aceptado en la actualidad divide a las células T inmaduras (timocitos) en tres estadíos de desarrollo, en los cuales la citometría de flujo ha desempeñado un papel fundamental (7 11) (figuras 1011).

Los timocitos precoces (estadío 1) expresan CD2 y CD5, además de CD7, CD38 y CD71.  Al desarrollarse las células en timocitos comunes (estadío 11) adquieren CDla, CD4 y CD8.  En esta fase la molécula CD3 se encuentra en el citoplasma y todavía no esta presente en la superficie.  Los linfocitos T experimentan procesos de selección positiva y negativa durante los cuales se selecciona el CD4 o CD8, de acuerdo a sí el receptor esta restringido a antígenos HLA de clase 1 o de clase 11 (1) (Figura 12).
 
 

Figura 10.  Esquema hipotético de diferenciación de células T humanas en análisis de inmunofenotípo de la LLA-T y timocitos de niños.  Se indica el inmunofenotípo de las células T en los varios estados de diferenciación.  Los marcadores inmunológicos en paréntesis no se expresan siempre.  Las líneas punteadas representan los compartimientos tisulares donde se encuentran los varios tipos celulares.
 

Figura 11. Esquema hipotético de diferenciación linfoide T. La Barras horizontales representan la situación endistintas leucemias agudas o crónicas, de acuerdo con su maduración.
 

Figura 12. Un modelo para el blanco de las células T, esto es, la interacción de las células B y T con el antígeno presentado.  Las células T restringidas a la clase I (citotóxicos, supresores) expresan el antígeno CD8 mientras que las células T restringidas a la clase II (cooperadoras) expresan el antígeno CD$,Las células que abandonan el timo son linfocitos T colaboradores/ inductores (CD4 +) caracterizados por restricción HLA de clase II y linfocitos T citotóxicos/ supresores (CD8 +) caracterizados por restricción HLA de clase I.Las células en el estado de timocito maduro ( estadío III) expresan CD3 en la superficie, pierden el CDI y pueden expresar CD4 o CD8, pero no ambos.

El paso de timocito maduro a célula T periférico viene señalado por la pérdida de parte de su reactividad para el antígeno CD38.

Tras la selección tímica, menos del 1% de los linfocitos generados en el timo sobreviven y pasan a la circulación (7).

Los linfocitos T periféricos pueden encontrarse en un estado de reposo o activados.  Estos dos estados pueden diferenciarse por algunas características inmunofenotípicas.  Tras la activación, los linfocitos T adquieren el receptor para la Interleucina 2. Además, los linfocitos T activados pueden expresar antígenos HLA-DR que normalmente no se expresan en reposo y el CD 71 que es el receptor para la transferrina (1, 2, 7).

Otros antígenos de los, linfocitos T.
Los antígenos CD2, CD3 y CD5 se encuentran presentes en todos los linfocitos T normales y un cuarto antígeno, el CD7, está presente en aproximadamente el 85% de las células T periféricas.  Estos cuatro antígenos se denominan pan T. El antígeno CD2 es el lugar de unión de los hematíes de carnero en la formación de rosetas.  El antígeno CD3 se encuentra unido de forma no covalente al receptor del antígeno de célula T y éste complejo es esencial para la activación dependiente del antígeno de los linfocitos T. A su vez.  El CD5 funciona como la molécula que une al antígeno BC72 (1, 7).
 

Diferenciación de los linfocitos B:
Los linfocitos B se originan en la médula ósea donde experimentan una fase primaria de diferenciación.  La diferenciación de las células B va acompañada de una serie de cambios en el genotipo (reordenamientos en los genes de las inmunoglobulinas similar al del receptor TCR de los linfocitos T), y de la adquisición y pérdida en la membrana de una serie de antígenos.  El desarrollo de las células B puede dividirse en tres estadíos amplios: células pre-B, que son los precursores de las células B inmaduras que no han adquirido aún las inmunoglobulinas de superficie; células B, células B maduras inmunocompetentes que expresan inmunoglobulinas de superficie y células plasmáticas, que son células de estirpe B diferenciadas terminalmente, que han perdido las inmunoglobulinas de superficie que funcionan para producir inmunoglobulina en cantidades masivas (figura 13).

La citometría de flujo ha sido fundamental en el establecimiento de las etapas de diferenciación de los linfocitos B (1, 7).

El desarrollo de los marcadores de superficie de las células B es el siguiente: los precursores más inmaduros expresan solo los antígenos HLA-DR y el CD34, mientras que los antígenos CD19, CDIO y CD20 se van expresando secuencialmente, seguido de la expresión de las cadenas pesadas y citoplasmáticas y finalmente de las inmunoglobulinas de superficie.  La transición de éste último estadío se acompaña de la pérdida del antígeno CD 10 (7, 11).  Una vez que los linfocitos adquieren IgM de superficie, se considera que se han convertido en células B maduras.  Las células B maduras expresan IgM de superficie y/o IgD, antígenos de clase 11, C3 y receptores Fc de IgG y los antigenos pan de células B. La mayoría expresan CD24 y CD21.  Una pequeña fracción de células B de los adultos normales expresan el antígeno CD45.  La diferenciación de las células B posterior a la médula ósea no se conoce muy bien y no es posible definir con exactitud los estadíos discretos por la expresión de antígenos particulares.  Las células B terminalmente diferenciadas o células plasmáticas difieren fenotípicamente de la mayoría de células B. Carecen de los antígenos de clase II, del antígeno pan de leucocitos CD45 y de la mayoría, sino de todos los antígenos pan de células B. Se encuentran ausentes las inmunoglobulinas de superficie, aunque son abundantes las inmunoglobulinas citoplasmáticas (1, 7, 11).Antígenos característicos de los linfocitos B:
Los antígenos específicos de los linfocitos B son CD19, CD20 y CD22.  El antígeno CD 19 se expresa muy precozmente en el desarrollo de las células B y continúa su expresión hasta justo antes de la diferenciación en células plasmáticas.  El CD20 se expresa más tardíamente que el CD19 en el desarrollo de los linfocitos B y parece estar relacionado con la expresión de las cadenas pesadas citoplasmáticas.  El CD22 es específico de los linfocitos B y se pierde durante su transición a células plasmáticas (1, 7).



Figura 13.  Esquema hipotético de la diferenciación linfoide B y fenotipo observado en los correspondientes síndromes proliferativos.
 

Las células  NK ( asesinas naturales):
Las células NK carecen de marcadores de células T o B específicos y tienen la capacidad de destruir células infectadas por virus y ciertas células tumorales, todo ello sin sensibilización previa (actividad natural).  Las células NK se originan a partir de un precursor hemopoyético en la médula ósea, donde maduran y desde donde pasan a la circulación, sin embargo, su proceso de diferenciación se desconoce en gran medida.  La citometría de flujo con marcaje múltiple ha sido fundamental en la caracterización fenotipica de estas células.  La mayoría de células NK se caracterizan fenotipicamente por la expresión de CD2 y el pan T CD7. Las células NK expresan también las moléculas CD 11a-c Y CD 1 8 asociadas a función linfocitaria.  Los antígenos CD16, CD56 y CD57 son marcadores que reconocen células con actividad NK, definiendo las células NK en ausencia de CD3/ TCR (1, 7).

ResumenDurante la última década, avances en las técnicas inmunológicas han hecho posible la identificación de receptores específicos, antígenos y otras moléculas sobre la membrana o el citoplasma de las células linfoides.  Además de la caracterización morfológica, el análisis de marcadores inmunológicos pueden caracterizar adicionalmente las células hemopoyéticas de los varios estados de diferenciación.  Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos de diferenciación, ellos no son específicos para un estado de diferenciación, sino que se expresan en diversos estados.  Sin embargo, la expresión de un grupo específico de marcadores puede asignar a una célula en un estado particular de diferenciación.  Diversos marcadores no restringen a un estado de diferenciación, sino que son expresados en diversos linajes (linaje B, T o mieloide).  Las LLA y las leucemias linfocíticas crónicas son las contrapartes malignas de los estados de diferenciación inmaduros y más maduros.

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*   Laboratorio Clínico, Hospital Calderón Guardia
** Laboratorio Clínico, Hospital San Vicente de Paul